De aanwezigheid van twee afdelingen onder één dak geeft het Bonnefantenmuseum zijn eigen karakter. De afdeling oude kunst bevindt zich op de eerste verdieping en toont o.a. hoogtepunten van de 16e en 17e eeuwse Vlaamse kunst uit het Rijksmuseum te Amsterdam. Door de samenvoeging van deze werken uit de Nationale Schatkamer met de collectie van het Bonnefantenmuseum wordt hét verhaal verteld van de schilderkunst in de 16e en 17e eeuw in de Zuidelijke Nederlanden. De collectie onderscheidt zich verder door grote ensembles en zaalvullende installaties van jongere kunstenaars.
